Молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене BRAF

Анализ мутаций в гене BRAF в биопсийном (операционном) материале

Молекулярно-генетическое исследование биоптата (либо операционного материала) позволяет выявить мутации гена BRAF и установить причины развития злокачественной опухоли.

Характеристики исследования:

• Тип биоматериала: Биоптат опухолевой ткани в емкости с фиксирующим раствором или парафиновый блок с биоптатом ткани опухоли. Может использоваться как образец первичной опухоли, так и полученный из метастатического очага.
• Синонимы (rus): Генные мутации при меланоме, BRAF, мутация BRAF, белок сигнального пути, меланома кожи.
• Синонимы (eng): BRAF, BRAF mutation testing, BRAF Gene Mutation Analysis, melanoma, BRAF Gene Mutation Test.
• Метод исследования: автоматическое секвенирование.

Ген BRAF кодирует синтез белков основного сигнального пути, функциональная деятельность которых заключается в регуляции (под контролем биологически активных веществ – гормонов и факторов роста) процессов пролиферации и сохранения клеток. Мутации данного гена провоцируют гиперактивацию сигнального пути (цепи, по которой сигнал от рецептора эпидермального фактора роста, локализованного на клеточной мембране, передается в ядро гена), «запуск» неконтролируемого деления клеток и развитие злокачественных патологий:

1. меланомы;
2. не мелкоклеточного рака легкого;
3. папиллярно-тироидной опухоли;
4. карциномы яичников;
5. колоректального рака;
6. аденокарциномы простаты.

Успешность современных методов химиотерапии онкологических заболеваний связана с:

• молекулярными механизмами формирования злокачественных новообразований;
• степенью патологических изменений ткани;
• способностью таргетных лекарственных препаратов воздействовать на опухолевые клетки.

Изучение влияния мутаций гена BRAF на патогенез опухолей позволило разработать новые фармакологические средства – Вемурафениб, Дабрафениб, Зелбораб (низкомолекулярные ингибиторы мутированного фермента серин-треонин-киназы, активирующего рост клеток). Эти препараты позволяют блокировать патологический сигнальный каскад, обусловленный BRAF мутациями, и тормозить развитие опухолевидного образования.

Когда делают генетический анализ?

Молекулярно-генетический анализ мутаций в гене BRAF в биопсийном (операционном) материале проводится при:

• подтверждении диагноза меланомы кожи, папиллярной опухоли щитовидной железы, карциномы толстой и прямой кишки, рака яичников и простаты;
• прогнозировании течения неоперабельной или метастатической меланомы;
• оценивания возможности лечения низкомолекулярными ингибиторами. 

Как подготовиться к анализу?

Биологический материал для исследования – ДНК опухолевых клеток, выделенная из биоптата либо операционной ткани. Образец опухоли может находиться в фиксированном растворе или парафиновом блоке, позволяющем длительно хранить ткань и использовать ее для других диагностических исследований.

Тактику подготовительных мероприятий для пациента разрабатывает лечащий врач. Для составления заключения необходим гистологический протокол.

Важность исследования

Молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене BRAF привело к значительному прорыву в диагностике, прогнозировании и лечении злокачественных новообразований. Обычно опухоли развиваются внезапно, на первых этапах не вызывая никакой клинической симптоматики. Это крайне опасно, так как пациент продолжительно не обращается к врачу, поэтому атипичные клетки быстро размножаются, что приводит к прогрессированию злокачественного новообразования. Если диагностику не провести своевременно, развивается ряд осложнений:

• значительное разрастание параметров опухоли, которая по мере увеличения повреждает соседние здоровые структуры (ткани, сосуды, нервы), а также прорастает вглубь окружающих тканей;
• развитие неоперабельной опухоли, которую невозможно удалить из-за тесной связи с жизненно важными органами или крупными кровеносными сосудами;
• формирование множественных метастазов, что является неблагоприятным прогнозом, приводит к смертельному исходу.

Обычно опухоли внутренних органов хорошо поддаются терапии в случае обнаружения на ранних этапах развития, то есть на первой и второй стадии. Чем дольше не проводить диагностику, тем тяжелее дается лечение. На поздних стадиях оно может оказаться не эффективным, поэтому назначаемые методы терапии лишь улучшают качество и продолжительность жизни. Если же своевременно провести молекулярно-генетическое исследование мутации в гене BRAF, можно определить следующую информацию:

• наличие нормальных критериев гена BRAF, что свидетельствует о том, что злокачественное новообразование не могло развиться из-за его дефектов;
• мутации в гене BRAF, что является следствием развития злокачественного новообразования;
• составление прогноза, который зависит от вида мутаций;
• назначение качественных методов терапии, которые будут одновременно блокировать разрастание опухоли, тормозить ее прогрессирование, приведут к возможности выполнения хирургического вмешательства.

Назначение на исследование получают от онколога. Его выполняют только по строгим показаниям, так как взятие биоматериала подразумевает под собой хирургическое вмешательство. Это приводит к отсутствию возможности выполнения методики в профилактических целях.

Для чего необходим анализ

Молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене BRAF выполняют для получения информации:

• дифференциальная диагностика различных видов злокачественных новообразований внутренних органов с другими диагнозами, которые могут приводить к схожим симптомам;
• составление адекватного прогноза в случае, если опухоль разрослась до таких размеров, что ее невозможно удалить хирургическим вмешательством или произошло распространение метастазов;
• подбор качественных методов терапии, а именно возможность применения низкомолекулярных ингибиторов, которые обладают высоким эффектом в случае мутаций в гене BRAF.

Если у пациента наблюдается тяжелая форма злокачественного новообразования, может потребоваться провести повторное исследование. Тогда при новой биопсии с последующим молекулярно-генетическим анализом можно оценить эффективность терапии на фоне мутаций в гене BRAF.

Особенности исследования

При проведении молекулярно-генетического исследования мутаций в гене BRAF на основе биопсийного материала важно учесть некоторые особенности:

• методику выполняют только по небольшому кусочку ткани, который был получен из опухоли (биопсийный материал);
• на основе биопсийного материала можно проводить не только молекулярно-генетическое исследование, но также гистологический анализ, чтобы оценить структуру атипичных клеток под микроскопом, это поможет составить более достоверный диагноз и определить критерии злокачественного новообразования;
• исследование сложное, многоступенчатое, к ткани добавляют специфические реагенты, чтобы выделить именно тот фрагмент генетического материала, который подлежит исследованию, только затем выполняют ПЦР-методику;
• так как ПЦР анализ проводится в автоматическом режиме, получают точные и достоверные данные по содержанию гена BRAF;
• методика качественная, то есть выявляют лишь наличие или отсутствие гена BRAF, его точное количество вычислять нет необходимости;
• методика может выполняться продолжительно за счет многоэтапности, но на основании этих данных можно быстро установить достоверный диагноз и сразу же приступить к лечению.

Это исследование особенно важно проводить в случае, если других мутаций генов не выявлено, но при этом опухоль продолжает разрастаться, а методы терапии не помогают. Часто идентификация мутации в гене BRAF позволяет откорректировать методы терапии, чтобы улучшить состояние пациента.

Подготовка к анализу

Взятие биосийного материала – это инвазивная процедура, поэтому пациент должен проходить последовательные этапы подготовки:

• исключение употребления тяжелой пищи за 1-2 дня до анализа;
• в случае изъятия кусочка ткани из пищеварительного тракта недопустимо употребление жирной, острой, жареной, копченой, чрезмерно соленой еды и продуктов, приводящих к повышенному газообразованию за 3 суток;
• запрет распития алкогольных напитков за 1-2 дня;
• минимальный период голода 8 часов, запрет употребления жидкости за 4 часа, так как в большинстве случаев для взятия биоматериала необходим общий наркоз.

Если придерживаться всех перечисленных этапов, можно значительно снизить риск любых осложнений, возникающих в процессе хирургического вмешательства.

Метод исследования

Изъятый кусочек ткани предварительно обрабатывают парафином. Создают блоки, которые предотвращают изменения в клетках, сохраняют целостность структуры ткани вплоть до транспортировки в лабораторию. Уже там приступают к следующим этапам исследования:

• удаление парафина специальными химическими веществами, в которые достаточно разместить блок, чтобы он очистился самостоятельно;
• переработка ткани из цельного кусочка, чтобы получить необходимое количество патологических клеток, которые требуется идентифицировать через дальнейшие этапы;
• обезвоживание полученного биоматериала, в таком виде он будет более восприимчив к реагентам;
• добавление реагента на основе специфических зондов, которые размещаются на поверхности искомой ДНК, чтобы выделить ее участки, подлежащие определению;
• добавление фермента, который встраивается в созданные структуры, вызывая специфическое свечение благодаря флюоресцентной метке, именно по ней возможна дальнейшая идентификация;
• размещение полученного образца в автоматический анализатор с заданием программы для выявления мутаций в гене BRAF.

В анализаторе произойдет многократное размножение генетического материала, чтобы получить достаточный объем, подлежащий оценке. Именно в таком виде аппарат сможет определить его наличие и выдать точные результаты. В конце исследования врач-лаборант заносит данные по наличию или отсутствию патологического гена, точных разновидностей мутаций, в таком виде их оценивает врач-онколог.

Расшифровка анализа

Заключение исследования может иметь следующие варианты:

• BRAF мутации не обнаружены, свидетельствует об отрицательном результате анализа;
• при положительном результате перечисляются выявленные мутации гена.

При интерпретации итоговых данных исследования учитываются результаты инструментального обследования пациента и дополнительных лабораторных тестов.