Молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене EGFR

Анализ биоптата опухолевой ткани (либо операционного материала)

Молекулярно-генетическое исследование биоптата опухолевой ткани (либо операционного материала) позволяет обнаружить мутации гена EGFR и проводится для определения причины возникновения онкопатологии и выбора правильного лечения.

Характеристики исследования:

• Тип биоматериала: образец ткани (в парафиновом блоке).
• Синонимы (rus):  прогноз терапии при НМРЛ, мутации гена рецептора эпидермального фактора роста - EGFR, немелкоклеточный рак легкого, тест на мутации гена EGFR, таргетная терапия.
• Синонимы (eng):  Epidermal Growth Factor Receptor Mutation Analysis, HER-1, erbB-1, EGFR Mutation Testing. 
• Метод исследования: автоматическое секвенирование.

Ген EGFR кодирует функциональную деятельность специфического белка, обладающего тирозин-киназной активностью – рецептора эпидермального фактора роста. Наличие мутаций данного гена провоцирует неконтролируемый рост атипичных клеток, который приводит к формированию не мелкоклеточного рака легких – опасного злокачественного новообразования, которое формируется из эпителиальных клеток дыхательных органов и занимает «почетное» I место по летальным исходам от онко-патологий.

При EGFR-мутациях происходит изменение аминокислотной последовательности рецептора эпидермального фактора роста – биологически активного белка, который локализуется в клеточной оболочке и запускает каскадные реакции сигнального пути. В результате этого явления происходит синтез аномального рецептора, способного активировать пролиферацию атипичных клеток, рост опухоли и стимуляцию ее метастазирования.

Успешность современных методов лечения опухолевидных образований зависит от установления молекулярных механизмов их возникновения и рационального применения фармакологических средств нового поколения (таргетных медикаментов), способных «прицельно» воздействовать на опухолевые клетки. В отличии от стандартных химиотерапевтических препаратов они не оказывают воздействия на нормальные ткани, однако их применение возможно лишь в случаях выявления специфической «мишени». Проникая в атипичные клетки, они ингибируют ключевые энзимы патологических биохимических реакций и препятствуют передаче стимулов для разрастания ткани.

Когда делают анализ биоптата опухолевой ткани?

Проведение анализа на обнаружение EGFR-мутаций рекомендует Европейское Общество Онкологов перед применением таргетных препаратов, которые используются для целевой терапии рака легкого – Гефитиниба, Тайверба, ингибиторов тирозин-киназы, Эрлотиниба.

Как подготовиться к анализу?

Биологическим материалом для исследования могут служить:

• парафиновый блок опухолевой ткани, фиксированный формалином;
• свежезамороженная ткань опухоли;
• срезы ткани опухоли в парафине.

Тактику подготовительных мероприятий определяет врач, ведущий пациента.

Важность исследования

Одна из самых опасных форм злокачественного новообразования – не мелкоклеточный рак легких. Он склонен к агрессивному течению за счет дефекта эпидермального фактора роста. В итоге активируется неконтролируемая пролиферация с низкой дифференцировкой клеток, поэтому опухоль значительно увеличивается в размерах. Патологию требуется идентифицировать на ранних этапах развития. Это затруднительно, так как изначально она не приводит к изменениям, симптомы отсутствуют. В большинстве случаев новообразование обнаруживают случайно, в ходе профилактического обследования респираторного тракта. При его выявлении требуется провести дифференциальную диагностику. Для этого используют биопсию ткани опухоли. На ее основании проводят два основополагающих анализа:

• гистологическое исследование для дифференциальной диагностики не мелкоклеточного рака легких;
• молекулярно-генетический анализ для оценки содержания различных генетических поломок, в данном случае определяют мутации EGFR.

Если на основании гистологии устанавливают диагноз, то только при помощи молекулярно-генетического анализа можно не только выявить причину опухоли, но также составить правильные методы терапии. Подбирают таргетные препараты, которые воздействуют именно на структуру опухоли, но не вызывают повреждения собственных тканей. Если блокировать мутантный ген EGFR таким средством, можно добиться следующих результатов:

• замедление роста и развития злокачественных клеток;
• остановка разрастания опухоли;
• уменьшение параметров опухоли, что помогает подготовить пациента к хирургическому вмешательству;
• предотвращение перемещения опухоли в соседние здоровые ткани, что повышает шанс на полное удаление новообразования и снижает риск рецидива;
• уменьшение риска распространения метастазов по другим внутренним органам, помимо респираторной системы;
• уничтожение атипичных клеток в метастазах в случае распространения злокачественного новообразования до 3 и 4 стадии, что позволяет улучшить качество и продлить период жизни.

Таргетную терапию можно проводить только при выявленных мутациях, поэтому без молекулярно-генетического анализа к подобной терапии не приступают.

Для чего необходим анализ

Молекулярно-генетический анализ по выявлению мутаций в гене EGFR необходим для получения следующей информации:

• выявление первичного повреждающего фактора, который спровоцировал развитие не мелкоклеточного рака легких;
• причины бесконтрольного влияния эпидермального фактора роста, который стимулирует пролиферацию и трансформацию нормальных клеток в атипичные элементы;
• оценка потребности в использовании ингибиторов EGFR, которые будут действовать на злокачественное новообразование патогенетически, а именно уничтожать только атипичные клетки, замедлять их развитие, приводить к уменьшению параметров опухоли;
• оценка возможности применения таргетной терапии у пациентов с локализованной и метастатической опухолью;
• выявление причин отсутствия эффективности от предыдущих методов терапии, чтобы в дальнейшем поменять препарат для достижения большего эффекта.

Исследование необходимо для комплексной оценки опухоли, чтобы у врача была возможность назначить более современные и действенные методы терапии, которые обладают меньшим перечнем побочных эффектов, чем ранее применяемая химиотерапия.

Особенности исследования

В случае назначения молекулярно-генетического исследования мутаций в гене EGFR учитывают ряд особенностей:

• методику можно проводить только на основании полученного биопсийного материала, то есть кусочка ткани, изъятого из опухоли;
• предварительно проводят гистологический анализ для подтверждения факта наличия злокачественного новообразования, только затем на этой же ткани применяют молекулярно-генетическое исследование;
• предварительно обрабатывают кусочек ткани, чтобы получить биоматериал, в котором содержатся реагенты, встроенные в структуру гена EGFR (причем содержится не просто реагент, а дополнительная флюоресцентная метка, по которой анализатор определяет наличие или отсутствие мутаций);
• как только завершена подготовка биоматериала, приступают к следующему этапу, в основе которого лежит ПЦР-методика, идентифицирующая точное содержание гена EGFR, а также наличие или отсутствие мутаций;
• после проведения анализа получают качественный результат, то есть выявляют наличие или отсутствие мутации, но точное содержание мутантных генов не оценивают (этой информации достаточно, чтобы составить точный диагноз и подобрать правильные методы терапии);
• в случае отрицательного результата дополнительно исследуют другие мутантные гены, которые могли привести к не мелкоклеточному раку легких, так можно одновременно выявить причину поражения и подобрать лечение;
• мутантный ген EGFR в большинстве случаев встречается при не мелкоклеточном раке легких, но также может появляться при злокачественном новообразовании в толстой кишке, молочных железах, поджелудочной железе.

Важно помнить, что для комплексной оценки не мелкоклеточного рака легких недостаточно одной биопсии с гистологическим и молекулярно-генетическим анализом. Важно выявить ее другие параметры, для чего используют инструментальные методы диагностики.

Подготовка к анализу

Для проведения молекулярно-генетического исследования мутации EGFR необходимо проведение биопсии. То есть это изъятие кусочка ткани из зоны поражения (злокачественной опухоли). Для этого необходимо малоинвазивное вмешательство с дополнительным введением анестезии. К процедуре готовятся по этапам:

• исключение из рациона питания продуктов, которые могут вызвать тяжелую нагрузку на пищеварительную систему и в целом организм за 3 дня;
• запрет распития алкогольных напитков за 1-2 дня;
• исключение тяжелой физической нагрузки накануне исследования;
• запрет проведения рентгенографии, компьютерной и магнитно-резонансной томографии за 7-10 дней.

Биопсию приходят натощак, последний период употребления пищи вечером, примерно за 6-8 часов до анализа. Нельзя пить жидкости за 4 часа.

Метод исследования

Фрагмент полученной ткани обрабатывают парафином для сохранения структуры, затем доставляют в лабораторию. Как только начинается молекулярно-генетическое исследование, парафин удаляют реагентами. Затем приступают к остальным этапам:

• повышение температуры биоматериала до 72°;
• обработка биоматериала реагентом с зондами, которые встраиваются в структуру ДНК для идентификации;
• внесение фермента, который создает на поверхности меченых генов флюоресцентную метку;
• внесение биоматериала в ПЦР оборудование, которое первоначально умножает количество генетического материала, затем определяет все мутации, которые могут появиться в гене EGFR.

Все выявленные данные записывают в лабораторный бланк. Если мутации отсутствуют, будет отмечен отрицательный результат. В случае их выявления описывают все выявленные нарушения. Дальнейшей расшифровкой занимается врач-онколог.

Расшифровка анализа биоптата опухолевой ткани

Заключение исследования может иметь следующие варианты:

1. Мутации в гене EGFR не обнаружены – отрицательный результат.

2. Наличие активирующих EGFR-мутаций является положительным результатом. Могут быть выявлены такие полиморфные варианты, как:

• Del19;
• L858R;
• Ins20;
• T790M;
• G719X;
• L861Q;
• S768I.

Перечисленные мутации гена указывают на резистентность организма пациента к таргетным средствам. Своевременное ее выявление позволяет установить причину отсутствия эффективности лечения и выбрать адекватную тактику лечебных мероприятий.