Анализ мутаций в гене KRAS в биопсийном (операционном) материале

Молекулярно-генетическое исследование биопсийного материала, выполняемое методом секвенирования ДНК, позволяет обнаружить мутации в гене KRAS и проводится для диагностирования злокачественных опухолей.

Характеристики исследования:

Тип биоматериала: Образец ткани, образец ткани в парафиновом блоке.
Синонимы (rus): KRAS, анти-EGFR антитела, немелкоклеточный рак легкого, мутация KRAS, колоректальный рак.
Синонимы (eng): KRAS, anti-EGFR antibodies, colorectal cancer, KRAS mutation, non-small cell lung cancer.
Метод исследования: полимеразная цепная реакция.
Сроки выполнения: 16 дней

Ген KRAS является представителем семейства белков, которые активируют транскрипции генов и сигнальные пути регуляции дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток, ангиогенеза и метастазирования опухолевидных образований. Мутации данного гена сопровождают большинство случаев различных онкологических патологий, отличающихся своей агрессивностью – быстрым распространением метастаз в регионарные лимфатические узлы и отдаленные органы, а также малой эффективностью проводимой терапии. K-RAS мутации встречаются при полипах и аденомах толстого кишечника, карциноме поджелудочной железы и прямой кишки. Именно поэтому полиморфные варианты гена используют в качестве диагностических маркеров этих патологий.

В настоящее время точечные мутации KRAS обнаруживают приблизительно у 45% пациентов с коло-ректальным раком – опасным заболеванием, которое требует серьезных комплексных лечебных мероприятий.

В современной молекулярно-прицельной химиотерапии используются 2 типа препаратов:

Ингибиторы рецептора эпителиального фактора роста.
Антитела к белку EGFR.

Эффективность их применения зависит от наличия активирующих KRAS мутаций – при их отсутствии наблюдается увеличение средней продолжительности жизни пациента и снижение количества рецидивов патологии. Выявление в клетках новообразования мутантных вариантов онкогена не приводит к положительным результатам использования фармакологических средств.

Когда делают анализ мутаций в гене KRAS?

Молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене KRAS проводят при:

изучении генетических факторов, которые могут повлиять течение злокачественного процесса;
прогнозировании исхода онкологической патологии;
оценивании успешности таргетной терапии.

Как подготовиться к анализу?

Биологическим материалом для исследования может служить биоптат, свежезамороженная опухолевая ткань, полученная во время оперативного вмешательства, либо фиксированная формалином. Тактику подготовительных мероприятий к процедуре взятия биоматериала определяет квалифицированный специалист, ведущий пациента.

Важность исследования

Злокачественные новообразования в толстом кишечнике и поджелудочной железе обладают динамикой к быстрому прогрессированию. В короткие сроки опухоль разрастается в размерах, прорастает сквозь ткани, приводит к образованию метастазов в других тканях. Поэтому при упущенном диагнозе и отсутствии качественного отслеживания динамики развития патологии прогноз становится неблагоприятным. Это основная причина определения мутации гена KRAS, важность которого опосредована получением следующих сведений:

выявление основных генетических факторов, которые приводят к более агрессивному течению злокачественного новообразования;
составление правильного прогноза развития злокачественного новообразования, в большинстве случаев при выявлении патологического гена он становится неблагоприятным, так как маркер указывает на более агрессивное течение болезни, сниженное воздействие методов терапии на очаг поражения;
отслеживание состояния пациента, который перешел в стадию ремиссии, но затем возник риск рецидива, поэтому необходимо повторно составить комплексную оценку злокачественной опухоли;
подбор специфических препаратов на основе ингибиторов EGFR, которые будут максимально эффективны при условии обнаружения мутации гена KRAS.

При помощи других методов исследования можно установить достоверный диагноз. Но только при вспомогательном определении мутации в гене KRAS врач составляет полноценную картину течения патологии. Если не использовать диагностику при обнаружении колоректального рака, могут произойти следующие отклонения:

отсутствие эффективности таргетной терапии, что приведет к дальнейшему разрастанию опухоли;
повторное появление новообразования после проведенного хирургического вмешательства;
быстрое появление метастазов, которые образуются, несмотря на лечение.

Если же мутация в гене KRAS отсутствует, назначаемые методы терапии быстро приведут к результату, поэтому высок шанс на выздоровление после рака толстого кишечника или поджелудочной железы.

Для чего необходим анализ

Молекулярно-генетическое исследование мутации в гене KRAS в биопсийном материале проводят для изучения следующей информации:

первичная диагностика выявленной злокачественной опухоли, чтобы определить патологический ген KRAS, при наличии которого снижается эффективность многих тактик лечения;
определение генетической предрасположенности, влияющей на степень развития новообразования;
составление правильного прогноза, в большинстве случаев выявленная мутация свидетельствует о неблагоприятном исходе;
составление шансов на успешность таргетной терапии, в случае выявления мутантного гена подбирают специфические препараты для усиления влияния на новообразование, а также исключают средства, которые будут неэффективны.

Важно помнить, что само молекулярно-генетическое исследование мутации не выявляет опухоль. Это вспомогательное исследование, назначаемое при уже составленном диагнозе, чтобы более тщательно изучить новообразование. Но на основе этого же биоматериала врач может провести гистологическое исследование, чтобы подтвердить факт наличия или отсутствия атипичных клеток. Поэтому достаточно взять один срез ткани, выполнив два анализа, чтобы провести дифференциальную диагностику.

Особенности исследования

Особенности исследования Для молекулярно-генетического исследования мутации в гене KRAS в операционном материале выделяют ряд особенностей:

диагностику осуществляют на небольшом срезе ткани, который берут из области развития злокачественной опухоли;
в случае объемного новообразования врач берет ткани из разных участков, чтобы максимально точно изучить клетки и мутации в генах;
предварительно проводят гистологический анализ для подтверждения диагноза злокачественного новообразования, только затем проводят молекулярно-генетическое исследование для определения мутации;
суть молекулярно-генетического анализа сводится к выявлению и многократному увеличению выявленной ДНК, в которой определяют генетические особенности с помощью ПЦР анализа;
период выполнения анализа максимально длится до 16 дней, так как предварительно необходимо подготовить биоматериал, после чего провести детекцию при помощи ПЦР-анализатора;
благодаря ПЦР оборудованию данные всегда получаются точными, можно выявить патологический ген KRAS даже в случае, если он содержится в тканях в минимальном количестве.

Обычно методику проводят лишь однократно. Ее повторение возможно в случае, если врач-онколог повторно назначает биопсию ткани для определения эффективности лечения в случае высокой агрессивности опухоли.

Подготовка к анализу

Перед проведением процедуры биопсии пациент должен пройти поэтапную подготовку, чтобы получить максимально точные данные и исключить осложнения:

за неделю придерживаются щадящего режима питания с исключением жирной, жареной, острой, копченой, чрезмерно соленой еды, чтобы снизить нагрузку на поджелудочную железу и кишечник;
за 3 дня исключают употребление продуктов питания, которые приводят к метеоризму в кишечнике – бобовые, сдоба, газировка, капуста;
последний период употребления пищи за 8 часов до хирургического вмешательства;
предварительное испражнение кишечника непосредственно перед процедурой (обычно используют клизмирование);
запрет распития алкогольных напитков за 2 дня;
последний период употребления жидкости за 4 часа.

Перечисленные этапы подготовки обязательны, без них может возникнуть повышенная нагрузка на организм в процессе биопсии.

Метод исследования

Расшифровка анализа Молекулярно-генетическое исследование мутации в гене KRAS начинается сразу после получения образца ткани в процессе биопсии:

предварительная обработка ткани парафином, который оставляют вплоть до момента начала исследования, после чего его удаляют;
нарезание ткани на тончайшие, прозрачные слои, которые располагают на стерильных предметных стеклах;
удаление лишней жидкости, для этого повышают температуру биоматериала до 72°
введение специфических зондов, которые выстраиваются в структуру ДНК, чтобы выделить требующийся фрагмент, подлежащий дальнейшей детекции;
многократное копирование выявленного фрагмента, чтобы получить достаточно генетической информации, которую сможет обнаружить оборудование;
проведение процедуры отмывки, в течение которой удаляют все не связавшиеся компоненты, чтобы оставить только ту разновидность ДНК, которую необходимо определить;
отслеживание наличия или отсутствия мутантного гена KRAS при помощи полуавтоматического оборудования, которое определяет его посредством детекции специфического флюоресцентного свечения, выделяемого меткой.

Врач распечатывает выявленные данные на лабораторном бланке. Их необходимо сопоставить с другими методами исследования, чтобы составить полноценную картину о состоянии опухоли в кишечнике или поджелудочной железе. Поэтому расшифровкой полученных сведений должен заниматься только врач-онколог.

Расшифровка анализа

Итоговые данные исследования выражаются следующим образом:

Наличие мутации в гене КRAS (gly – 12ala, 12asp, 12arg, 12cys,12ser, 12val, 13asp) – положительный результат, который считается неблагоприятным прогнозом при онко-патологии. Проведение лечебных мероприятий требует персонифицированного подхода.
Отсутствие КRAS мутации – отрицательный результат.

При интерпретации заключения исследования учитывают данные комплексного обследования пациента, включающего инструментальные методы и дополнительные лабораторные тесты.

Молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене KRAS

Кошурин Дмитрий Валерьевич