Соскоб на коринебактерии дифтерии

Полимеразная цепная реакция на Corynebacterium  diphtheriae соскоба из зева, носа, миндалин, направлена на обнаружение ДНК дифтерийной палочки. Даже если в соскоб попадает часть бактерии, или хотя бы одна палочка, этого достаточно для положительного результата ПЦР. Данный высокочувствительный метод позволяет выявить патологию на самых начальных этапах развития заболевания, без клинических проявлений.

Дифтерия относится к инфекционным заболеваниям, которые вызываются токсигенными штаммами коринебактерии дифтерии. Болезнь сопровождается изменениями на слизистых оболочках ротоглотки с образованием плотных фибриновых плёнок, поражением нервной ткани и сердечно-сосудистой системы.

Тип биоматериала: соскоб со слизистой зева, ротоглотки, носа

Синонимы (rus): ПЦР на бациллы Лефлера,ПЦР на Bl

Синонимы (eng): Corynebacterim diphtheria,DNA(PCR),qualitative, saliva

Методы: полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

Цель исследования

ПЦР анализ ДНК Corynebacterium diphtheriae проводят для получения следующей информации:

• наличие или отсутствие патогенного микроорганизма, который вызывает инфекционное заболевание дифтерию;
• оценка риска заражения дифтерией после контакта с пациентом, у которого был подтвержден диагноз (для этого требуется предварительно выждать инкубационный период до 1 недели, затем проводить анализ, чтобы он показал точные результаты);
• дифференциальная диагностика с другими заболеваниями, которые вызывают схожие симптомы – повышение температуры тела от 39° и больше, утомляемость, слабость, артралгия, миалгия, отек и серая пленка на миндалинах, хриплый голос, тяжелое и затрудненное дыхание, отек шеи;
• оценка потребности в назначении специфических антибактериальных средств, которые будут воздействовать именно на Corynebacterium dyphteriae;
• проверка качества лечения спустя несколько недель после завершения методов терапии, чтобы подтвердить полное устранение микроорганизма, предупредив возможность рецидива (если часть бактерий останется в организме пациента, это может вызвать повторное заражение с высоким риском развития резистентности бактерии к действующему веществу антибиотика).

Особенность ПЦР методики заключается в определении генетической информации, которая содержится в ДНК бактерии. Подобные гены характерны только для Corynebacterium dyphteriae, поэтому получение ошибочных сведений полностью исключено. Тест всегда показывает достоверную информацию, по ней можно сразу же определить диагноз и приступить к лечению.

Коринебактерии дифтерии

Патогенный микроорганизм Corynebacterium diphtheriae представляет собой граммположительную палочку с тонкой и немного изогнутой структурой, вызывающую дифтерию. В процессе жизнедеятельности палочка обладает следующими особенностями:

• не образует спор;
• быстро развивается, размножается и распространяется по организму человека, в отличие от нетоксигенных штаммов;
• быстро взаимодействует с эпителием верхних отделов дыхательных путей, проникает внутрь его структуры, поэтому именно в этом участке развивается активный воспалительный процесс и формирование серой пленки (она состоит из бактерий  и продуктов их жизнедеятельности).

После распространения в дыхательной системе коринебактерия приводит к следующим симптомам:

• повышение температуры тела вплоть до высоких значений;
• интенсивная боль в горле, развивающаяся вследствие поражения миндалин с последующим образованием пленки на их поверхности и повышенной реакцией иммунитета;
• постепенное перемещение пленки от миндалин на полость носа, глотку;
• интенсивный и грубый кашель;
• в некоторых случаях развивается воспалительное поражение миокарда, нервных волокон.

Способность образовывать токсины имеют лишь штаммы, имеющие в геноме ген tox, кодирующий токсин. Дифтерийный токсин представляет собой полипептид, состоящий из двух фрагментов: A и B. Фрагмент А проявляет ферментативную активность. Фрагмент В взаимодействует с клеточными рецепторами, облегчая проникновение фрагмента А.

Дифтерия развивается медленно, но на поздних этапах способна приводить к следующим осложнениям для верхних отделов респираторного тракта:

• нарушение тембра голоса вплоть до его полного исчезновения;
• изменение качества дыхания – продолжительный и тяжелый вдох, шум во время дыхания;
• постепенное развитие гипоксии, что приводит к нарушению функциональности внутренних органов.

Патология опасна развитием миокардита, почечной недостаточности, обильным поражением нервных волокон. Дополнительно у пациента ухудшается качество иммунитета, присоединяется вторичная инфекция.

Показания к назначению

ПЦР исследование по определению коринебактерии проводят при наличии следующих показаний:

• контакт с пациентом, у которого был подтвержден диагноз дифтерии за счет заражения токсигенным штаммом;
• симптомы, свидетельствующие о развитии дифтерии, в особенности это касается серой пленки, которая покрывает поверхность миндалин, полости носа и ротоглотки;
• завершение лечения дифтерии, чтобы судить о его успешности или потребности в назначении дальнейшей терапии;
• атипичная ангина, на которую не действуют привычные лекарственные средства;
• положительный микробиологический анализ на дифтерию, чтобы уточнить и подтвердить диагноз.

Показания определяет лечащий врач, чаще всего это инфекционист. Если диагноз будет подтвержден, пациента требуется разместить в инфекционную больницу для постоянного наблюдения врача и изоляции от других людей.

Как подготовиться к анализу

Для успешного проведения анализа важна предварительная подготовка, о которой предупреждает инфекционист:

• устранение лекарственных средств, которые могут повлиять на содержание микроорганизма (особенно это касается антибиотиков, недопустимо употреблять их до утверждения диагноза);
• отсутствие употребления пищи минимум за 4 часа до исследования, большинство врачей советуют проводить его с утра на голодный желудок (также не рекомендуется употреблять жидкости);
• исключение чистки зубов за несколько часов до анализа;
• исключение применения любых местных средств, которые воздействуют на полость рта и ротоглотку (спреи, растворы для полоскания, сосательные таблетки, капли в нос);
• высмаркивание носа в случае обильного накопления слизи непосредственно перед исследованием;
• полоскание полости рта кипяченой водой перед сбором биоматериала.

Подобные правила связаны с тем, что для проведения ПЦР берут соскоб из полости носа и ротоглотки.

Процесс забора соскоба на Corynebacterium  diphtheriae

• Пациент находится в положении сидя с откинутой назад головой и открытым ртом.
• Сначала производят осмотр слизистых при хорошем освещении, используя шпатель.
• Небные миндалины и участки с налётом протирают чистым стерильным тампоном.
• Зондом производят соскоб с видоизмененных оболочек. Не прикосаясь к языку и зубам, аккуратно переносят в пробирку типа «Эппендорф», закрывают пробирку притртой крышкой и маркируют её. В лабораторию материал транспортируется при температуре не выше 80С.
• Соскоб подлежит исследованию в ближайшие 24 часа.
• Врачом в направлении указываются антибиотики, применяемые до взятия биоматериала.

Метод ПЦР с детекцией в режиме реального времени

Для проведения ПЦР методики предварительно берут соскоб из носа и ротоглотки, располагая в стерильном контейнере. Биоматериал отправляют в лабораторию, где быстро приступают к исследованию, чтобы не допустить изменения состава микрофлоры. ПЦР проводят по этапам.

1. Повышение температуры биоматериала. Ее увеличивают до 96°, чтобы спровоцировать разрыв водородных связей, которые удерживают нити ДНК, скручивая их в цепочки. Как только это произойдет, каждая нить превратится в отдельный генетический материал.
2. Охлаждение образца. Температуру снижают до 72°, чтобы приступить к следующему этапу.
3. Добавление праймера. В реагенте содержится специфический компонент, который взаимодействует с нитью ДНК, выделяя ее начало и конец. Именно в этой области будет проходить дальнейшее исследование.
4. Увеличение количества генетического материала. Одной нити ДНК для идентификации патогенного микроорганизма недостаточно. Поэтому его объем многократно увеличивают, копируют.
5. Определение возбудителя инфекции. Для этого используют ДНК зонд, который взаимодействует с генетическим материалом. По этой метке лабораторный анализатор в точности определяет принадлежность к определенному виду бактерий. В данном случае это Corynebacterium dyphteriae.

Предварительная информация по содержанию возбудителя инфекции будет указана на мониторе аппарата, поэтому оценить результат можно в режиме реального времени. Затем данные распечатывают, в них содержится информация об инфекции. Тест бывает положительным или отрицательным.

Расшифровка анализа на коринебактерии дифтерии

Corynebacterium diphtheriae не входит в условно-патогенную микрофлору. Поэтому у здорового человека бактерия не должна обнаруживаться. Это означает, что анализ должен быть отрицательным.

При выявлении малейшего фрагмента генетической информации коринебактерии анализ будет положительным. Это означает, что для расшифровки результат пациент должен обратиться к лечащему врачу, который проведет дополнительное обследование, чтобы в точности установить диагноз. В случае, если анализ положительный, но симптомы не проявляются, назначают повторную диагностику. Это может свидетельствовать о ранее пережитой инфекции и сохранении небольшого количества микроорганизма в соскобе слизистой оболочки носовых ходов или ротоглотки.